ix-1

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az IEX-1 expressziója megnő a fehér zsírszövetben HFD táplálás után
  • Az IEX-1 hiány miatt az egerek ellenállnak a HFD által kiváltott elhízásnak
  • Az IEX-1 hiány javítja a glükóz anyagcserét
  • Az IEX-1 hiánya gátolja a HFD által kiváltott zsír- és májgyulladást
  • Az IEX-1 hiánya növeli az energiafelhasználást a fokozott termogenezis miatt
  • Az IEX-1 hiány megakadályozza a zsírszövet makrofág fenotípusának HFD által kiváltott változását
  • vita
  • mód
  • Állatok és állatok gondozása
  • Teljes vér és plazma mérések
  • Glükóz és inzulin tolerancia tesztek
  • szövettan
  • immunhisztokémia
  • immunblotta
  • SVF izolálás és immunfenotipizálás
  • RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR elemzés
  • Teljes állati energiafelhasználás és hőtermelés
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • Hozzászólások

elemeket

absztrakt

Az elhízás napjaink egyik legveszélyesebb közegészségügyi problémája magas gyakorisága (59 millió amerikai) és számos krónikus betegség, például a 2-es típusú cukorbetegség, az érelmeszesedés, a magas vérnyomás, az alkoholmentes zsírmáj, az immunrendszer által közvetített rendellenességek miatt. és bizonyos típusú rákok. A fontos anyagcsere-szövetekben, beleértve a zsírszövetet és a májat, krónikusan alacsony aktív gyulladásszint társul. A krónikus gyulladás megváltoztatja a glükóz és a lipid anyagcserét, és túlzott energiatároláshoz és 2, 3, 4, 5, 6 inzulinrezisztenciához vezet. A legújabb tanulmányok jelentős bizonyítékokkal szolgáltak arra vonatkozóan, hogy a veleszületett immunválasz és az azt követő gyulladás sokkal korábban jelentkezik, mint az elhízás kialakulása, és kritikusan hozzájárulnak annak patogeneziséhez 2, 4, 5, 6. Különösen az NF-κB, központi gyulladásos mediátor, játszik nagy szerepet az étrend okozta gyulladásban. Az NF-κB és későbbi mediátorainak blokádja az egereket nemcsak az inzulinrezisztencia által kiváltott inzulinrezisztenciától, hanem az 5, 7, 8 elhízástól is megvédi, ami alapvető összefüggésre utal a gyulladás és az energiafelhasználás között. A gyulladás anyagcsere-egyensúlyhiányban való részvételének erős bizonyítéka ellenére az elsődleges mediátorok, amelyek magas zsírbevitel mellett felborítják az energiaegyensúlyt, még nem teljesen meghatározatlanok.

az eredmény

Az IEX-1 expressziója megnő a fehér zsírszövetben HFD táplálás után

Az IEX-1 hiány javítja a glükóz anyagcserét

Az IEX-1 hiánya növeli az energiafelhasználást a fokozott termogenezis miatt

vita

Az elhízás krónikus rendellenesség, amely a 2., 3., 5., 6., 8. energiacsere egyensúlyhiánya miatt következik be. Az energiafogyasztás elsődleges élettani szabályozói, különösen a magas kalóriabevitel mellett, nem teljesen ismertek. Itt bemutatjuk az IEX-1 eddig ismeretlen szerepét az energia-anyagcserében. A null IEX-1 mutáció megvédi az egereket a HFD által kiváltott elhízás és inzulinrezisztencia kialakulásától. Az IEX-1 -/- egerek megnövekedett energiafelhasználást mutattak a fokozott termogenezis miatt. Szövetspecifikus vizsgálatok azt mutatják, hogy az IEX-1 hiány növeli a termogén gének expresszióját, és az eWAT és az scWAT megbarnulását okozza, összhangban az IEX-1 fokozott expressziójának megfigyelésével kizárólag ezekben a szövetekben HFD-vel táplálva. Ez magyarázza a KO egerek fokozott termogenezisét és energiakiadását, amely mechanikus képet nyújt ezen egerek sovány fenotípusáról. A tanulmány az IEX-1-et az energia-anyagcsere fontos modulátoraként azonosítja a magas kalóriabevitel során, és új célpontot kínál az elhízás és más anyagcserezavarok kezelésére.

Azt, hogy az IEX-1 hiány hogyan képes fenntartani a zsír AAM-okat, még tisztázni kell. Az IEX-1 nagymértékben expresszálódik a 11, 12, 14 makrofágokban. Döntő szerepet játszik az apoptózis szabályozásában az immunsejtekben, és szabályozza azok heterogenitását 9, 12, 16, 33, 34, 35, 36. Például korábban beszámoltunk arról, hogy az IEX-1 kölcsönösen szabályozza a T-sejt túlélését és az apoptózist részhalmazfüggő módon 16, 36. Az IEX-1 hiány növeli a Th1 apoptózisát, miközben elősegíti a Th17 sejtek túlélését, ami fokozott IL-17 válaszhoz vezet a colitis és arthritis egérmodelljeiben. Talán a HFD által kiváltott IEX-1 aktivitás a makrofágokban feltételezett antiapoptotikus hatása révén elsősorban az elhízott zsírokban növeli a CAM alcsoport túlélését, de az AAM-ok nem. Ezért az IEX-1 hiánya megakadályozza a HFD által kiváltott CAM-populáció növekedését. Mindazonáltal adataink azt sugallják, hogy az IEX-1 szükséges az ATM fenotípusú HFD által kiváltott kapcsoláshoz, ezáltal szabályozva az AAM-ok által közvetített beiginget.

A zsíros makrofágok döntő szerepet játszanak az elhízással járó gyulladásban azáltal, hogy elhízott zsírokban 7, 18, 37, 38 elhízott zsírokban fenotípusukat gyulladásgátló állapotról (AAM) gyulladáscsökkentő állapotra (CAM) váltják. Az IEX-1 hiány gátolta az ATM-ek átmenetét, és így az AEX-ek domináltak az AEX-ekben az IEX-1 -/- egerek WAT-ban még 20 hetes HFD után is, biztosítva egy mechanizmust, amely révén az IEX-1 hiány gátolja a HFD által kiváltott gyulladást. Feltehetően az IEX-1 -/- egerekben megnövekedett AAM-populáció és gyengített gyulladás járulhatott hozzá az ezen egerekben megfigyelt javuló inzulinérzékenységhez 32, 39. Az IEX-1 az elhízással társult gyulladás új közvetítője lehet, valószínűleg az ATM-ek fenotípusának szabályozásában játszott szerepe miatt. Ezért azt javasoljuk, hogy az IEX-1 kettős hatást fejtsen ki az elhízásban ATM-eken keresztül; (i) elősegíti a CAM által kiváltott gyulladást és (ii) gátolja a bézs zsír zsírképződését.

Összefoglalva, a jelen tanulmány az IEX-1 korábban nem értékelt szerepét azonosította az energiaszabályozásban. Az IEX-1 hiány barnulást és aktivált termogén géneket váltott ki a WAT-ban azáltal, hogy elősegítette a zsírmacrofágok alternatív aktiválódását a HFD-táplálás során. Következésképpen az IEX-1 -/- egereket megvédték a HFD által kiváltott súlygyarapodástól a fokozott termogenezis és a megnövekedett energiafelhasználás miatt. A makrofágok alternatív aktiválása szintén gyengítette a HFD által kiváltott gyulladást és javította az inzulinrezisztenciát. Hogy az IEX-1 hiány gátolja-e az elhízás kialakulását, az AAM-ok fenntartása az elsődleges mechanizmus.

mód

Állatok és állatok gondozása

Az összes egérvizsgálatot a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó NIH útmutatónak megfelelően végeztük. Valamennyi tanulmányt az MGH Kutatóállat-gondozási Albizottsága felülvizsgálta és hagyta jóvá. IEX-1 -/- egereket állítottunk elő laboratóriumunkban a korábban leírtak szerint 17. Ebben a vizsgálatban hím egereket alkalmaztunk 129Sv/C57BL/6 háttérrel. Az IEX-1 -/- egerek és WT alomtársuk magas zsírtartalmú étrendet (zsíros kalóriák 45% -a; D12451 Research Diets Inc.) vagy normál chow-t (zsírból származó kalória 13,2%) tápláltak, 8 hetes kortól kezdve, 20 héten keresztül. Az állatokat egy specifikus kórokozótól mentes létesítményben helyeztük el, 12 órás fény/12 órás sötét ciklus mellett az MGH állattartó létesítményeiben, és ad libitum táplálékot és vizet kaptunk. A rektális hőmérséklet felvételeit FHC Precision hőmérővel (FHC Bowdoin ME) határoztuk meg dél körül. A testsúlyt kéthetente monitorozták a vizsgálat során.

Teljes vér és plazma mérések

A teljes vért heparinizált csövekbe gyűjtöttük, és a plazmát centrifugálással elválasztottuk. A plazma inzulin koncentrációit inzulin ELISA kit segítségével (Crystal Chem Inc., Downers Grove IL) mértük. A vércukorszintet One Touch Ultra Accuchek glükométerrel mértük. A plazma teljes koleszterint, triglicerideket és NEFA-t kolorimetriás vizsgálattal (Wako, Cambridge MA) mértük. A plazma TNF-α-t és IL-10-et ELISA kitekkel mértük (eBioscience).

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

Az IGTT alkalmazásához az egereket intraperitoneálisan injektáltuk 1,5 mg glükóz/testtömeg-g 12 óra éhgyomorra 5. A vércukorszintet bazális, 15, 30, 45, 60 és 120 perc alatt mértük a farok vérétől a glükométer segítségével. Az ITT esetében az egereknek intraperitoneális injekciót adtak 0,75 egység humán inzulin (Novolin, Novo Nordisk) testtömeg-kilogrammonként 3 óra éhgyomorra 5 után. A vércukor-koncentrációt a fent leírtak szerint határoztuk meg.

szövettan

Boncolás után a mintákat 10% pufferolt formalinban 48–72 órán át merítve rögzítettük, dehidratáltuk, tisztítottuk, majd paraffinba ágyazottuk. Soros szakaszokat (5 μm vastagságot) kapunk, és paraffinmentesítjük, rehidratáljuk, majd hematoxilinnal és eozinnal festjük. Ezután a metszetek képeit egy NanoZoomer segítségével szkennelték, és az NDP view szoftver (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) segítségével elemezték. Az eWAT metszetek egy mintájánként 100 véletlenszerűen rendezett adipocita átlagos adipocita területét határoztuk meg NDP view szoftver segítségével.

immunhisztokémia

A formalinnal rögzített paraffinba ágyazott szövetszelvényeket paraffinmentesítettük és rehidráltuk az antigén leplezése előtt 10 mM nátrium-citrátban forralva és 0,1% TBS-Tritonnal 15 percig permeabilizálva. Az endogén peroxidáz aktivitást 3% -os hidrogén-peroxiddal 15 percig tartó inkubálással leállítottuk. A metszeteket normál kecskeszérumban blokkoltuk, és primer nyúl anti-IEX-1 (ab65152 Abcam, Cambridge MA) vagy anti-UCP1 (ab10983 Abcam) antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. szobahőmérsékleten, és a színt 3, 3′-diaminobenzidinnel (DAB) tettük láthatóvá Vecta-stain ABC kit (Vector Laboratories) felhasználásával. Az UCP1 kimutatására szolgáló metszeteket polimer AP nyúlellenes szekunder antitesttel festettük 30 percig szobahőmérsékleten (Biocare Medical, Brookline MA), és a színét gyorsan vörös kromogén (Biocare Medical) hozzáadásával tettük láthatóvá. A metszeteket dehidrálás előtt hematoxilinnal festették be, és a fedőlemezeket rögzítő közeggel helyezték el. A diákat NanoZoomer segítségével szkenneltük, és NDP view szoftver segítségével elemeztük (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).

immunblotta

A szöveteket proteáz és foszfatáz inhibitorokkal (Sigma-Aldrich) kiegészített RIPA foszfátpufferben gyűjtöttük. Az extraktumokat 4–20% Miniprotein TGX gél (BioRad, Waltham MA) alkalmazásával frakcionáltuk, nitrocellulóz membránokra helyeztük, és az egér IEX-1 (1: 200; sc33171 Santa Cruz Biotech, Dallas TX), UCP1 (1) ellen primer antitestekkel inkubáltuk.: 5000 eWAT és scWAT és 1:20, 000 BAT, ab10983 Abcam) vagy α-tubulin (abcam) számára egy éjszakán át 4 ° C-on. Mosás után a membránokat HRP-hez kapcsolt anti-nyúl IgG-vel (Cell Signaling Technology) inkubáltuk. . A membránokat ECLPlus-szal (GE Healthcare, Wilmington, MA) inkubáltuk, és a kemifluoreszcenciát Versadoc 4000MP képalkotóval detektáltuk. A felvett képeket ImageJ szoftverrel (NIH) elemezték.

SVF izolálás és immunfenotipizálás

Genotípusonként 4-5 hím egeret mély anesztézia alatt intraperitoneálisan beadott ketamin (120 mg/kg) + xilazin (12 mg/kg) keverékkel eutanizáltak. Az epididymális WAT-ot összegyűjtöttük, ollóval ledaráltuk, és 1 mg/ml kollagenáz II-vel emésztettük CaCl2-t (1,4 mM) és BSA-t (0,5%) tartalmazó PBS-ben 30 percig, 37 ° C-on, rázógépben. Az emésztést azonos mennyiségű 10% FBS-t tartalmazó DMEM hozzáadásával állítottuk le. A sejtszuszpenziót 100 μm-es szűrőn átszűrjük, majd 5 percig 300 g-on centrifugáljuk, hogy a lebegő adipocitákat elválasszuk a stromalis vaszkuláris frakciótól (SVF). Az SVF-pelletet 0,5 ml vörösvérsejt-lizáló pufferben 5 percig jégen szuszpendáltuk, 5 percig 300 g-vel centrifugáltuk, és FACS pufferben (PBS 2% BSA-val) 6 x 106 sejt/ml koncentrációban újraszuszpendáltuk. A sejteket sötétben, jégen inkubáltuk 20 percig az Fc blokkban (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia). Mosás nélkül a sejteket fluoreszcensen jelölt antitestekkel: F4/80-fikoeritrinnel, CD11c-fikoeritrinn-Cy7-vel és CD206-Alexaflour 647-vel inkubáltuk további 30 percig a gyártó (BD Bioscience) utasítása szerint. A sejteket FACS Aria sejtrendezővel (BD Biosciences) elemeztük. Foltos és egyszeres foltokat használtunk a kompenzációk és a kapuk beállításához.

RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR elemzés

Az eWAT szöveteket vagy adipocitákat, valamint SVF-frakciókat egerekből nyertük, a fentiek szerint mély érzéstelenítésben, és az extrakcióig -80 ° C-on tároltuk. A teljes RNS-t Trizol (Invitrogen, Carlsbad CA) alkalmazásával extraháltuk. A cDNS-t a Superscript III első szálú szintézis készlet (Invitrogen) segítségével szintetizáltuk. Az mRNS expressziós szinteket kvantitatív valós idejű PCR-analízissel (qRT-PCR) mértük Mastercycler realplex 2-ben (Eppendorf) Kapa sybr fast vagy probe fast qPCR keverékkel (Kapa Biosystems) hagyományos Sybr vagy taqman alkalmazásával (IEX-1) alapozók. A relatív génexpresszió változását 18S mRNS szintre normalizáltuk, és a relatív Ct módszerrel határoztuk meg.

Teljes állati energiafelhasználás és hőtermelés

7–8 hétig HFD-vel vagy ND-vel táplált IEX-1 -/- egereket és WT alomtársakat (n = 4–5 genotípusonként) standard metabolikus ketrecekbe helyeztünk. Az oxigénfogyasztást (VO 2), a szén-dioxid-termelést (VCO 2), a hőtermelést, a spontán motoros aktivitást és az ételfogyasztást az átfogó laboratóriumi megfigyelő rendszer (TSE system Inc.), egy integrált nyílt áramkörű kaloriméter optikai sugárral történő felhasználásával mértük. tevékenységfigyelő rendszer. Ezeket a paramétereket 3 egymást követő napon (3 sötét ciklus és 3 fény ciklus) figyeltük, és az elemzések során 3 nap átlagértékeit használtuk. A légzéscsere arányt (RER) a VCO 2 és a VO 2 arányaként számítottuk ki. A testösszetételt Echo MRI analizátorral (Medical Device Company, Houston TX) mértük.

Statisztikai analízis

Valamennyi adatot átlag ± átlagos átlaghibákként (SEM) fejezzük ki. Két csoport vagy két kezelés, köztük az IEX-1 mRNS és a fehérje szintje közötti különbségeket az ND és HFD táplált WT egerekben, valamint a citokinek mRNS expresszióját ATM-ekben összehasonlítottuk egy Student kétfarkú t teszttel. Kétirányú ismételt mérések Az ANOVA-t a testtömeg, a vérparaméterek, az IGTT és az ITT során tapasztalt vércukorszint, az mRNS expressziós szintjének összehasonlítására az eWAT-ban, az scWAT, a BAT és a májban, a VO 2 és a hőtermelésben, valamint a CAM-ok és AAM-ok százalékos arányának összehasonlításában az SVF-ben. különböző csoportok. P értékek