elemeket
absztrakt
A Taconic Sciences (Tac) és a Jackson Laboratory (Jax) C57BL/6 (B6) egereit 16 hétig fertőztük H. pylori PMSS1-gyel (Hp); nem volt szignifikáns különbség a gyomor szövettani aktivitásában a Hp-vel fertőzött Tac és a Jax B6 között. Ugyanakkor a gyomornyálkahártya metaplázia és a Th1-hez kapcsolódó IgG2c szintek a Hp fertőzésre adott válaszként a Jax egerekben a Tac egerekben nőttek, míg a gyomor Hp kolonizációs szintjei 8-szor magasabbak voltak a Jax B6 Tac B6 szintjénél. Ezenkívül a gyomor IL-1β, IL-17A és RegIIIγ mRNS expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a fertőzött Tacs-ekben, mint a fertőzött Jax egerek. Jelentős különbségek voltak a gyomorban, a vastagbélben és a székletben található mikrobaközösségek szerkezetében a Jax és a Tac B6 nők között. Úgy gondolják, hogy a Jax és a Tac B6 nőstények közötti gyomor mikrobiális közösségei közötti különbségek befolyásolják a metagént. Ezenkívül a Hp-fertőzés megzavarta a Jax egerek gyomrában, vastagbélében és ürülékében a mikrobiális közösség szerkezetét, de a Tac egerekben csak a vastagbél mikrobiális összetételét változtatta meg. Adataink azt mutatják, hogy a Tac B6 egerek GI mikrobiome összetételében különbözik a Jax B6 egerektől, ami valószínűleg eltérő patológiás, immunológiai és mikrobiális válaszokat eredményezett a Hp fertőzésre.
A Helicobacter pylori fertőzés krónikus aktív gyomorhurutot, peptikus fekélyeket okozhat, és az 1, 2 gyomor adenokarcinóma kialakulásának fő kockázati tényezője. A világ népességének körülbelül 50% -a fertőzött ezzel a kórokozóval,
10% -uk gyomor- vagy nyombélfekélyt okoz és
A Th1 által érintett C57BL/6 egereket használtuk a H. pylori fertőzés által kiváltott gyulladásos gyomor karcinogenezis mechanizmusainak meghatározására 15. Különböző ileális mikrobiotikumokat figyeltek meg a Jackson (Jax) és a Taconic Bioscience (Tac) 16 C57BL/6 egereiben. Különösen a szegmentált fonalas baktériumok (SFB-k), a gram-pozitív spóraképző baktériumok egy csoportja vannak jelen a Tac egerekben, de Jax egerekben nincsenek. Az SFB elősegíti a Th17 sejtek gyulladásgátló válaszait, és fontos szerepet játszik a nyálkahártya IgA válaszainak kiváltásában is 16, 17, 18, 19, 20, 21. Tekintettel a mikrobiomnak és különösen az SFB-nek a gazdaszervezet immunválaszainak kialakításában betöltött szerepére, feltételeztük, hogy a H. pylori fertőzés kóros hatásokat és immunválaszokat indukál a C57BL/6 egerekben különböző gyomor-bélrendszeri mikrobákkal, amelyek új betekintést nyújthatnak a különböző GI mikrobiotikumok hatásaiba. a H pylori által kiváltott gyomor patológiájáról emberben. Ebben a vizsgálatban a gyomor patológiájának súlyosságát, a gyulladásos mediátorok expresszióját, a gyomor-bélrendszeri (GI) mikrobiómákat (gyomor, vastagbél, ürülék) és az SFB kolonizációs dinamikáját jellemezték a H. pylori fertőzésekre adott válaszként Jax és Tac C57BL/6 egerekben, és képest.
az eredmény
H. pylori-fertőzött Tac egereknél súlyosabb gyomornyálkahártya-metaplázia alakult ki, mint a pylori-fertőzött H. egerekben.
16 héttel a H. pylori oltás (16 WPI) után a H. pylori fertőzés szignifikánsan súlyosabb gyomor patológiát váltott ki mind a Tac, mind a Jax B6 egerekben, mint az álkontrolljaik (S1, P 
A nyálkahártya metaplázia súlyossága megnőtt a Tac B6 pylori fertőzött H. egerekben Jax társaikhoz képest. ( A ) A gyomornyálkahártya metapláziájának pontszáma (1-től 4-ig emelkedik), amely súlyosabb volt a fertőzött Tac egereknél. ( B ) Reprezentatív képek, amelyek kóros tulajdonságokat mutatnak a csoportok között.
Teljes méretű kép
A nyálkahártya metaplázia eredetének további jellemzéséhez megvizsgáltuk a nyálkahártya metaplázia (Tff2) és a SPEM (Tff2, GSII-lektin) markereinek expressziós mintáit a gyomorszövetekben, immunhisztokémia segítségével 22, 23, 24. Mind a Jax, mind a Tac kontroll gyomor korpuszában a nagyon enyhe Tff2 expresszió a nyaki nyálkahártya sejtekre és a bazális mirigyek szelekciójára korlátozódott, míg H. pylori-fertőzött egerekben a hyperplastikus és metaplasztikus mirigyek és/vagy foveolaris kutak fokozott és de novo immunfestése megfigyelték, és a gócok teljes nyálkahártya-hosszukon elterjedtek (2A ábra). Ezenkívül a Tff2 expresszió kifejezettebb volt a H. pylori-fertőzött egerek gyomrában, szemben a Jax-fertőzött egerekkel, elsősorban a nyálkahártya metaplázián átesett szegmensekben, ami korrelál a Tac-fertőzött egereknél megfigyelt fokozott nyálkahártya metapláziával. Hasonlóképpen számos GSII-pozitív mirigyet figyeltek meg mindkét szállító kontroll gyomrában (2B. Ábra). Ezzel szemben a gyomor GSII-lektin expressziója minden fertőzött egérben szignifikánsan megnőtt, a nem fertőzött kontrollokhoz képest. Továbbá a GSII-lektin expressziója megnőtt a fertőzött Tac B6-ban a H. pylori-fertőzött Jax B6-hoz képest (2B. Ábra).
A Tff2 és a GSII expressziója megnőtt a Tac B6 gyomor korpuszfertőzésében Jax társaikkal összehasonlítva. ( A ) Tff2 IHC a ( B ) GSII immunfluoreszcencia.
Teljes méretű kép
A gyomor H kolonizációjának fokozatai. A pylori szignifikánsan magasabb volt Jax egerekben, mint a Tac egerekben
Az életkornak megfelelő C57BL/6 egereket 16 hétig fertőztük H. pylori PMSS1-vel. Valamennyi fertőzött Jax egér pozitív volt a H. pylori, míg a 10 fertőzött Tac egérből 4 negatív volt a H. pylori esetében (3A. Ábra). Ezenkívül a gyomor H kolonizációjának átlagos szintje. A pylori értéke 8-szor magasabb volt Jax egereknél (3317 ± 1345), összehasonlítva a statisztikai szignifikancia nélküli H. pylori-pozitív Tac egerek (452 ± 219) szintjével (3A. ábra, P = 0,064).
Az ilealis SFB jelenléte dokumentálva van, amely robusztus Th17 választ vált ki 16. Így a gyomorszöveteken tesztelt összes gén transzkriptumszintjét is megmértük mind a fertőzött, mind a kontroll egerek ileumjában. Az IL-17A és az Ifnγ transzkriptum szintje szignifikánsan emelkedett a Tac egerekben a Jax egerekhez képest (S2. Ábra). Az Ileal Tnfa, Il-1p, Il-22, Il-10, Foxp3 és RegIIIy mRNS szintek összehasonlíthatók voltak a Tac és Jax egerek között, a fertőzés állapotától függetlenül.
A H. pylori fertőzés szignifikánsan növelte az SFB kolonizációs szintjét a Tac B6 egerek vastagbélében
Az SFP-specifikus qPCR 26 alkalmazásával a széklet SFB szintjét figyeltük meg az idő múlásával Jax és Tac egerekben, és mértük az SFB kolonizáció dinamikáját az ileumban, a vakbélben és a vastagbélben is. Az összes Jax egér SFB negatív volt az elemzett szövetekben. Oda-vissza. Az SFB-k az összes Tac egér ürülékében és ileumjában voltak, a kiválasztott egerek pedig a vastagbélben és a vakbélben pozitívak voltak SFB-re (4. ábra). Miután egy hét Tac B6 egeret elhelyeztek az MIT-ben, a széklet fekális SFB szintje jelentősen csökkent az érkezés utáni szintekhez képest (4A. Ábra). Ezt követően az SFB szintje fokozatosan csökkent 2-ről 16 WPI-re. A H. pylori fertőzés 4 WPI kivételével nem változtatta meg szignifikánsan a széklet SFB szintjét, míg a H. pylori fertőzés szignifikánsan növelte a széklet SFB szintjét.
Amikor a béta változatosságot súlyozatlan UniFrac alkalmazásával elemeztük, az egyes mintavételi helyek mikrobiális flóráját elsősorban a szállító csoportosította (5. ábra). A PCoA elemzés azt mutatja, hogy a gyomorban (P
A gyomor, a vastagbél és a széklet mikrobiális szerkezeteinek összehasonlítása Jax és Tac B6 egerek között. A fő koordináta-analízist (PCoA) (súlyozatlan UniFrac) a baktériumok 16S rRNS-génszekvenciái alapján végeztük ugyanazon mintamélységben (2743). Jax (narancssárga) és Tac (piros) egerek mintáit színes karikákként mutatjuk be. A P értékeket a megfelelő súlyozatlan UniFrac spacer mátrixon számítják ki az ADONIS assay és a 14 alkalmazásával, míg egy másik tanulmány arról számolt be, hogy a H, pylori fertőzés 30. A H. pylori fertőzés egerek alfa változatosságára gyakorolt hatásának értékelése azt mutatta, hogy a H. pylori fertőzés nem változtatta meg a Tac vagy Jax egerek gyomor-, vastagbél- vagy székletének változatosságát. Míg a H. pylori fertőzés nem változtatta meg szignifikánsan a sokféleséget a B6 egerekben, a PCoA elemzések (súlyozatlan UniFrac az ADONIS assay segítségével) kimutatták, hogy a H. pylori fertőzés jelentősen megváltoztatta a Jax B6 egerek gyomrában, vastagbélében és ürülékében a mikrobiális struktúrákat (P
Asztal teljes méretben
vita
A C57BL/6 (B6) egereket széles körben alkalmazták az orvosbiológiai kutatásokban, genetikai profiljuk alapos ismerete és számos transzgenikus egér törzsben történő felhasználása miatt. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a H. Pylori fertőzésre különböző válaszok vannak a B6 nőstény nőstényeknél, amelyeket a Jackson Laboratory (Jax) nyert Taconic Biosciences (Tac) ellen. A fertőzött Jax B6 egereknél magasabb volt a gyomor H kolonizációja. pylori, a gyomor Il-1β és Il-17A fokozott transzkripciója a fertőzött Tac társaikkal összehasonlítva. Ezenkívül a fertőzött Tac B6 egerekben súlyosabb gyomornyálkahártya-metaplázia és erősebb Th1-asszociált IgG2c-válasz volt H. pylori ellen a fertőzött Jax B6 egerekhez képest. Továbbá, a mikrobiómiai adatok azt mutatták, hogy a gyomor, a vastagbél és a széklet mikrobiális összetételeinek bősége és egységessége jelentősen különbözött a Jax és a Tac B6 törzsek között. A H. pylori fertőzés a Jax B6 nőstények minden vizsgált helyén (gyomor, vastagbél és ürülék) jelentősen megváltoztatta a mikrobiális közösség struktúráját, a mikrobaközösség szerkezete azonban csak a Tac megfelelője vastagbélében változott. Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy egy adott, különböző mikrobákkal rendelkező egér törzs eltérő gazda immunválaszokat és H. pylori által kiváltott kóros változásokat fejthet ki. .
Vizsgálatunkban a Tac B6 egerekben az SFB tartósan és túlnyomórészt kolonizálta az ileumot, függetlenül a fertőzés állapotától, ami az ilealis IL-17A mRNS több mint 100-szoros növekedésével járt együtt, a Tnfa és az IL-1β mRNS-sel azonban nem. egerek fertőzött pylori és kontroll egerek Jax. Az Ileal Ifnγ mRNS szintje szintén emelkedett az összes Tac B6 egérben, amely része lehet a gazdaszervezet válaszának a Th17 sejtpopuláció homoeostasisának fenntartására. Súlyosabb gyomornyálkahártya metaplázia és H. csökkenés A Tac B6 egerekben a Pylori-kolonizáció szintje azonban nem látszott közvetlenül az SFB jelenlétének köszönhető, mivel a gyomor IL-17A mRNS szintje összehasonlítható volt a Tac B6 egerek és a Jax B6 kontrollok között. A H. pylori fertőzés azonban megnövelte az SFB kolonizációs szintjét a vastagbélben, összhangban a H. hepaticus 26 fertőzött Tac Swiss Webster egerekben végzett korábbi eredményeinkkel. Mivel a Th17-sejtek sokféle patogén mikroorganizmus fertőzésével szemben képesek gazdasejtként védekezni 40, az SFB fontos szerepet játszhat a gyomor-bélrendszer mikrobiális struktúráinak kialakításában és fenntartásában a Tac B6 egerekben, amelyek összetételében különböztek a Jax B6 egerekétől. a Tac B6 egerek kóros és immunológiai reakciói H. pylori fertőzésekre .
Összességében kimutattuk, hogy a Jax és a Tac B6 egerei különböző GI mikrobiális közösségi struktúrákat tartalmaznak, és differenciális immun, patológiás és mikrobiális válaszokat fejlesztenek ki a H. pylori fertőzésekre. A Jax és a Tac B6 egerek GI mikrobiómáinak különbségei a szállítók közötti különböző tartási gyakorlatokból, valamint a 29, 41 C57BL/6 altörzsek fenotípusos és genetikai variációiból származhatnak. H. kölcsönhatása A pylori és a GI mikrobiota és az ebből eredő kóros kimenetel mind egerekben, mind emberekben egyre nyilvánvalóbbá válik. Eredményeink tovább hangsúlyozzák annak fontosságát, hogy meghatározzuk az adott vizsgálatban használt állatmodellek forrását, mivel ugyanazon beltenyésztett egér törzsnek különböző GI mikrobaközösségei lehetnek, amelyek különböző válaszokat diktálhatnak egy adott kísérleti kezelésre.
Anyagok és metódusok
Egerek és fertőzés
Az egereket a laboratóriumi állatok gondozásának értékelését és akkreditálását végző egyesület által akkreditált létesítményben tartották fenn. Minden állatgondozási és kísérleti eljárást a Massachusettsi Technológiai Intézet Állattenyésztési és -használati Bizottsága hagyott jóvá a laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának útmutatójával összhangban. Tizenöt 4 hetes nőstény C57BL/6 (B6) egeret vásároltunk a Taconic Biosciences (Tac) (Germantown, NY) és a Jackson Laboratory (Jax) (Bar Harbor, ME) cégektől. Az egerek mentesek voltak ismert egérvírusoktól, a Helicobacter spp. és paraziták, statikus mikroizolátor ketrecekben tartották őket, és táplálékkal (ProlabRMH3000) táplálták a PMI Nutrition International cégtől (Richmond, IN ) . Miután egy hétig karanténban volt, minden gyártó 10 egerét beoltották H-vel. pylori PMSS1 (amely funkcionális CagA-t tartalmaz), ahol az egyes gyártók 5 kontroll egerét, amelyeket külön fülkében helyeztünk el, ál-dózisban hordozóval adagoltunk. Az egerek 0,2 ml friss inokulát kaptak (
2 × 108 szervezet) gyomorszondával minden második nap, összesen három oltással.
Boncolás és hisztopatológia
Az egyes B6 egerek székletmintáit az inokuláció előtt, a H-vel történő oltást követően 2, 4, 8 és 16 héttel gyűjtöttük össze. pylori (WPI). Az egyes csoportokból származó összes fertőzött és kontroll egeret 16 WPI-vel eutanizáltuk. Közvetlenül a CO 2 -val rendelkező egerek eutanáziája után a kisebb görbület gyomormintáit gyűjtöttük össze és dolgoztuk fel a proximális duodenumon át a 31., 42. leírás szerint. A gyomorelváltozásokat egy összehasonlító patológus (S. Muthupalani) osztályozta, vakon megvizsgálva az azonosságot 0 és 4 közötti növekvő skálán gyulladás, hámhiányok, atrófia, hiperplázia, pszeudopilorikus metaplázia, dysplasia és nyálkahártya metaplázia szerint, ahogy máshol meghatározták 31. A gyomor hisztológiai aktivitási indexét (GHAI) úgy állítottuk elő, hogy összesítettük a pontszámokat. Ezenkívül a cecokolikus csomópontot és a vastagbélt paraffinba ágyazva 5 µm-nél metszettük, és szövettani kiértékelés céljából hematoxilinnel és eozinnal festettük, ugyanazzal a pontrendszerrel, mint korábban leírtuk .
DNS és RNS előállítása szövet- és székletmintákból
A gyomor és a belek tartalmát steril PBS-sel történő öblítéssel távolítottuk el. Az antrumot és a testet tartalmazó gyomorszövet egy darabját, valamint az ileum, a vakbél és a vastagbél egy centiméteres szegmenseit az RNS vagy DNS izolálásához összegyűjtöttük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk közvetlenül a mintavétel után, és használat előtt -70 ° C-on tároltuk. Az összegyűjtött szövetekből és székletmintákból származó teljes DNS-t a High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Applied Science, Indianapolis, IN) és a QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit alkalmazásával izoláltuk a szállítói protokoll szerint (Qiagen Inc., Valencia, CA), ill. A gyomor és a bél szöveteiből származó teljes RNS-t Trizol Reagensek alkalmazásával izoláltuk a szállító eljárásának megfelelően (Invitrogen, Carlsbad, CA). Az elkészített DNS vagy RNS tisztaságát a Nanodrop 2000C (Thermo Scientific, Wilmington, DE) alkalmazásával elemeztük.
immunhisztokémia
Az összes csoport gyomor szakaszait specifikus poliklonális nyúl anti-Tff2 IgG 22-vel festettük. Ezenkívül a gyomornyálkahártya nyaksejteket fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugált Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin II (GSII) alkalmazásával azonosítottuk, és a tárgylemezeket Vectashield plusz DAPI-val (4, 6-diamidino-2-fenilindol) szereltük fel (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia). A rutin immunhisztokémiát a korábban leírt módon, kisebb módosításokkal végeztük 22. Az antigéneket az antitestektől függően alacsony és magas pH-értéken, 45 percig 95 ° C-on inkubálva nyertük le, és a tárgylemezeket automatizált festőberendezéssel (Lab Vision Autostainer 360; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) festettük meg., USA), egymás után 10 perc ultraviziós peroxidáz blokkot, 30 perc R rágcsáló blokkot, primer antitesteket 30 percig, majd megfelelő másodlagos polimer alapú anti-nyúl IgG-t, majd diaminobenzidinnel kifejlesztve és H&E-vel festettük. A tárgylemezeket dehidratáltuk és megtisztítottuk, majd lefedtük a különböző markerek expressziós mintáinak kvalitatív értékeléséhez.
ELISA
Az alkalmazott módszerek a korábban publikáltak voltak 12 .
16S rRNS gén szekvenálás és elemzés
Szelektált citokinek expressziója
A kiválasztott gének relatív mRNS-mennyiségi meghatározásához a gyomorból és a B6 egerek ileumából származó teljes RNS-t Trizol reagens alkalmazásával állítottuk elő a gyártó ajánlásai szerint (Invitrogen, Carlsbad, CA). Minden mintából öt μg teljes RNS-t alakítottunk át cDNS-be a High Capacity cDNS Archive kit (Life Technologies) segítségével. A gyomor- és ilealis szövetekben az Ifnγ, Tnfα, Il-1β, Il-17A, Il-22, RegIIIγ, Il-10 és Foxp3 mRNS szintjét qPCR segítségével mértük kereskedelmi láncindítókkal és próbákkal (TaqMan Gene Expression Assays) a 7500-ban. GYORS, valós idejű PCR rendszer. A transzkriptum szinteket normalizáltuk az endogén kontroll glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz mRNS-re (Gapdh), és az álkontrollok (0-ként definiált) összehasonlításában történő változásként fejeztük ki összehasonlító küszöbciklus (CT) módszerrel (Applied Biosystems User Bulletin No. 2). ).
Statisztikai analízis
Adatok az SFB, H. szintjéről A pylori és a citokin expressziót több csoport között elemeztük Kruskal-Wallis teszt alkalmazásával, két csoport között pedig párosítatlan t teszt segítségével. A csoportok közötti GHAI-pontszámok elemzéséhez a Mann-Whitney U tesztet használtuk. P értékek