absztrakt

Míg a jelenlegi terápiák eleinte hatékonyak lehetnek, sok daganat végül kemorezisztenssé válik, ami a kezelés kudarcához vezet. Ennek eredményeként továbbra is sürgősen szükség van új terápiás megközelítésekre a petefészekrák kezelésében.

A pajzsmirigy betegség képalkotása és terápiája a pajzsmirigy jodid felhalmozódásának képessége miatt lehetséges. Ezt közvetíti a nátrium-jodid (NIS) szimbóluma, a transzmembrán glikoprotein, amely a pajzsmirigy follikuláris sejtjeinek bazolaterális membránján expresszálódik. A génterápia legújabb fejleményei számos olyan tanulmányhoz vezettek, amelyek célja a NIS expressziójának bevezetése más daganattípusokban a radiojód képalkotás és terápia biztosítása érdekében. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Nagyon hasznos lenne a NIS expressziójának petefészekdaganatokba történő bevezetése. A pajzsmirigy rádiójodid terápiában elterjedt, bizonyított eredményekkel együtt a NIS nagy előnyt nyújt terápiás génként, mivel képalkotást biztosít a célzott fehérje expresszió megerősítésére a terápia folytatása előtt. A 131 I alkalmazásával járó mellékhatás azt is jelenti, hogy a teljes terápiás hatás eléréséhez nem minden célsejtnek kell expresszálnia a NIS-t. 12.

A múltban leírtuk a MUC1 promóter sikeres alkalmazását a NIS expressziójának ösztönzésére a rádiójodid képalkotáshoz és az emlőrákos sejtek terápiájához. A MUC1 túlexpresszióról beszámoltak a legtöbb petefészekdaganatban is, 18, 19, 20, 21, és ezért ez a konstrukció alkalmazható ebben a daganatos modellben. Ez a tanulmány leírja a NIS expressziójának bevezetését a petefészek tumorsejtekbe in vitro és in vivo, majd ezt követően 123 I képalkotás és 131 I terápia követi.

A petefészekdaganatok újabb kihívást jelentenek a vírus által közvetített génterápia szempontjából, mivel kimutatták, hogy az adenovírus fertőzéshez szükséges molekulák változó szintjét expresszálják, mint például a coxsackievirus receptor és az adenovírus receptor (CAR), valamint az integrinek. Ezért két adenovírus konstrukciót, amelyek NIS-t tartalmaztak (1) citomegalovírus (CMV) vagy (2) MUC1 promóterek irányításával, használták a petefészekrák sejtvonalának (OVCAR-3) megfertőzéséhez, amelyekről a jelentések szerint mérsékelt CAR szintet expresszáltak. A hatásos, nem specifikus CMV promótert kezdetben használták annak meghatározására, hogy meghatározható-e funkcionális NIS expresszió ebben az in vivo modellben. A CMV/NIS által transzdukált daganatok sikeres kezelését követően a MUC1/NIS konstrukciót használták a MUC1-pozitív tumorok transzkripciós célzásának biztosítására és az extratumorális toxicitás kockázatának további csökkentésére. Ez a tanulmány ígéretes első lépést jelent a NIS által közvetített radiojód képalkotás és a petefészekdaganatok kezelésének lehetőségeinek feltárására.

az eredmény

125 I abszorpciós vizsgálatok

In vitro megvizsgáltuk az OVCAR-3 sejtek képességét a jodid felszívására különböző időpontokban Ad/CMV/NIS vagy Ad/MUC1/NIS fertőzés után (1. ábra). Az optimális jodidfelvételt 3 nappal a fertőzés után figyeltük meg, a CMV/NIS-transzdukált sejtekhez képest (4226 ± 169 cpm) 12-szeres növekedéssel (4226 ± 169 cpm) a kontroll sejtekhez képest, szemben a MUC1/NIS-transzdukált sejtek 5,5-szeresével (1898). . ± 23 cpm). A jódfelvételt minden esetben blokkolták a NIS működésének ismert gátlója, a KCLO4 jelenlétében.

közvetített

Jódfelvétel OVCAR-3 sejtekben különböző időpontokban, miután NIS-t tartalmazó adenovírussal fertőztek CMV vagy MUC1 promoterek irányítása alatt (fertőzés sokasága (MOI) 80). Az optimális jodidfelvételt mindkét konstrukciónál 3 nappal a vírusfertőzés után figyeltük meg. A jódfelvételt blokkoltuk a KClO 4, a NIS működésének ismert gátlója jelenlétében.

Teljes méretű kép

Western blot

A NIS-transzdukált petefészek-karcinóma sejtekből (OVCAR-3) származó membránfehérje-kivonatokat (10 μg) Western-blottolásnak vetettük alá humán NIS fehérje 468-643 aminosavai elleni egér monoklonális antitesttel (2. ábra). A CMV/NIS-sel (2a (ii) ábra) és a MUC1/NIS (2b (ii) ábra) fertőzött sejtekből származó membránkivonatok pozitívak voltak a NIS-fehérjére a várt méretnél -75-100 kDa. A NIS fehérje mérete a glikozilációs állapottól függ, és 50 és 110 kDa között lehet, 50 kDa a nem glikozilezett fehérjét képviseli. A CMV/NIS-transzdukált sejtekben kimutatott immunreaktivitás szintje erősebb volt, mint az a megfigyelt szint, amikor a NIS-t a MUC1 promoter irányította, annak ellenére, hogy ez a sejtvonal magas szintű MUC1 fehérjét expresszál. A kontroll vírussal fertőzött sejtekben nem detektáltunk NIS fehérjét (2a. Ábra (i) és b (i)), bár néhány gyenge nem specifikus sávot észleltünk.

A NIS expressziójának Western blot elemzése OVCAR-3 sejtekben fertőzés után. ( a ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/CMV/NIS. ( b ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/MUC1/NIS. Ad5/CMV/NIS-sel fertőzött OVCAR-3 sejtek membrán kivonatai ( a (ii.) és Ad5/MUC1/NIS ( b (ii)) erős immunreaktivitást mutatott az egér anti-NIS antitestjeivel szemben, amely a 75–100 kDa fehérjét mutatott ki. Mindkét esetben a kontroll vírussal transzfektált sejtek membrán kivonataiban nem detektáltuk a NIS expressziót ( a (én), b (én)).

Teljes méretű kép

immunhisztokémia

A NIS által transzdukált OVCAR-3 sejteket metanolban rögzítettük és immunhisztokémiai festésnek vetettük alá, hogy meghatározzuk a NIS fehérje helyét a sejtben (3. ábra). A CMV (3b. Ábra) vagy a MUC1 (3c. Ábra) promoterek irányítása alatt álló NIS-fertőzött sejtek szintén pozitívak voltak a membránra célzott citoplazmatikus NIS fehérje szempontjából. A NIS fehérje működéséhez a sejtmembránra kell irányulnia. Amikor a CMV promóter ellenőrzése alatt áll, úgy tűnik, hogy a NIS javította a membrán célzását, amely korrelált az 1. ábrán megfigyelt megnövekedett jodidfelvételi szinttel. A promoter nélküli vírussal fertőzött sejtek negatívak voltak a NIS immunreaktivitására (3a. Ábra).

A NIS expressziójának immunhisztokémiai elemzése OVCAR-3 sejtekben fertőzés után ( a ) ellenőrző vírus, ( b ) Ad5-CMV-NIS vagy ( c ) Ad5-MUC1-NIS. A NIS-transzdukált sejtekben mind a membrán, mind a citoplazmatikus NIS immunreaktivitás immunreaktivitását kimutatták. Promóter nélküli vírussal fertőzött sejtek ( a ) negatívak voltak a NIS immunreaktivitása szempontjából.

Teljes méretű kép

In vivo 123 I képalkotás

Három egér OVCAR-3 tumorjának in vivo képalkotása gamma kamerával 0,5 mCi 123 I beadása után 3 nappal a jodid beadása előtt az egereknek intratumorális injekciókat adtak Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS vagy kontroll vírusból. Mindhárom képen a jodid felszívódása látható a pajzsmirigyben és a gyomorban, amelyek expresszálják a NIS-t, valamint a hólyagban, ahol a jodid kiválasztódik a vizelettel. Kép ( a ) az Ad/CMV/NIS-sel fertőzött daganat tiszta képét is mutatja a bal szárnyon, a MUC1/NIS konstrukcióval injektált állatban a tumor kevésbé intenzív képe látható b ). A panelen ( c ), ahol a bal oldali daganatot kontroll vírussal fertőzték meg, nincs tumor kép.

Teljes méretű kép

131 I terápia

Az egerek 5x108 PFU Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS vagy Ad/CMV intratumorális injekciót kaptak, 3 nappal később pedig 3mCi 131I vagy sóoldat intraperitoneális dózisát. A daganat méretét (hosszúság × szélesség × magasság × 0,51) ezután hetente mértük féknyergekkel (5. ábra).

OVCAR-3 petefészek tumor xenográfok in vivo radiojód terápiája. A daganatokat Ad5/CMV/NIS, Ad5/MUC1/NIS vagy kontroll vírussal (szaggatott vonal) fertőztük, amelyet 131 l vagy sóoldat intraperitoneális dózisa követett. A statisztikai elemzést Student t-teszt alkalmazásával végeztük, P = 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Ad5/CMV/NIS + 131 I szemben Ad/CMV/NIS– 131 I, P 131 I az Ad5/CMV-vel (NIS nélkül) + 131 I, P 131 I, fokozatosan csökkentve 131 I-re, drámaian átlagra nőtt térfogat 268 ± 35 és a kiindulási térfogat 332 ± 154% -a (P 15, 28 az első olyan vizsgálat, amely állatmodellben beszámolt a petefészek daganatok NIS által közvetített 131 I terápiájáról.

Bár ezek az előzetes eredmények némileg ígéretesek a petefészekdaganatok NIS által közvetített terápiájának alkalmazásában, a CMV promoter által biztosított specifitás hiánya problematikus lehet. A legtöbb petefészekrák csak áttét után következik be, és így több disszeminált daganatból áll, amelyek gyakran a hasüregbe korlátozódnak. Ezért a vírus intraperitoneális beadása vonzó út ennek a betegségnek a kezelése érdekében a vírus/tumor sejt kölcsönhatás fokozása érdekében, ami azonban aggodalmakat vet fel a szelektivitással kapcsolatban. Nem invazív rádiójodid képalkotás végezhető a NIS helyes lokalizációjának megerősítésére a terápia folytatása előtt. A NIS expresszió transzkripciós célzása azonban potenciálisan növelheti a vírus dózisát a célsejtekhez, és elkerülheti a májra és a normális mesotheliális sejtekre gyakorolt ​​toxicitást.

Nemrégiben leírtuk a teljes tumor regressziót az Ad5/MUC1/NIS emlőrák xenograftok kezelése után egerekben. A petefészek-daganatok túlnyomó többségéről a MUC1, 18, 19, 20, 21 túlzott expressziója is beszámol, míg a normál mesotheliális sejtek gyengén vagy egyáltalán nem expresszálódnak. 29 A CMV/NIS konstrukció sikere után az Ad/MUC1/NIS-t alkalmaztuk a tumorok transzkripciós célzásának biztosítására és a környező normál sejtekre gyakorolt ​​lehetséges hatások minimalizálására. Jelen modellben annak ellenére, hogy az OVCAR-3 sejtek a robusztus MUC1 fehérjét expresszálják, a NIS expresszió 18 szintje nem volt elég magas ahhoz, hogy a 131 I terápia után daganat regressziót indukáljon. rák modell. A 123I képalkotás korlátozott jodidfelvételt mutatott a tumor helyén. A 8 hetes időpontban azonban a tumor mennyisége szignifikánsan kisebb volt a MUC1/NIS fertőzés és a 131 I terápia után a kontroll tumorokhoz képest. Ez arra utal, hogy a magasabb expressziós szinthez vezető fejlesztésekkel ez életképes megközelítés lehet ennek a tumormodellnek.

Az adenovírus által közvetített géntranszfer sikere a hatékony in vivo transzdukciótól függ. Egy enhancer elem beépítése a MUC1 promóter irányába növelheti a kapott NIS expresszió szintjét, de nem haladja meg a szuboptimális tumor transzdukciós sebességet. Számos csoport kimutatta a CAR-depletáló petefészkek petefészek-modelljeinek jobb fertőzését CAR-független vagy tropizmustól független adenovírus konstrukciók alkalmazásával a máj megkerüléséhez, és olyan specifikus sejttípusok megcélzásához, amelyek általában refrakterek az adenovírus fertőzésre. Ez növelheti a vírusterhelést a daganat helyén, és lehetővé teheti alacsonyabb vírusdózisok alkalmazását, ami potenciálisan csökkentheti az immunválaszt a vírus beadása után.

Az itt bemutatott ígéretes előzetes eredmények azt mutatják, hogy a petefészek daganatok radiojód képalkotását és kezelését kombinálják módosított adenovírus vektorok képződésével, ami a NIS által közvetített terápia lehetőségét sugallja, mint új megközelítést a petefészekrák kezelésében.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

Az OVCAR-3 petefészek karcinóma sejtvonalat 10% magzati szarvasmarha szérummal és penicillin G (2 U/ml)/sztreptomicin szulfáttal (100 mg/ml) kiegészített RPMI táptalajban tartottuk fenn. A sejteket 37 ° C-on tartottuk, 5% CO 2 táptalajjal hetente kétszer cseréltük és az átjárást 7 naponta.

Adenovírus termelés

A ViraQuest Inc.-vel együttműködve elkészítettünk egy replikációhiányos humán rekombináns adenovírus 5. szerotípus konstrukciót, amely humán NIS-t tartalmazott a MUC1 promoter (-1401 - +33) irányítása alatt. (North Liberty, IA, USA), a fent leírtak szerint. Röviden: a MUC1/NIS inszertet a ViraQuest által szolgáltatott VQ/5k plazmid vektorba klónoztuk, majd 293 sejtbe transzfektáltuk, amelyek adenovírus DNS-t tartalmaznak, amely korábban az El régió egy részének eltávolítására korlátozódott. A lepedéktisztítás után a rekombináns Ad/MUC1/NIS adenovírust 293 sejtben kibővítettük, és CsCl-sűrűség gradiensen végzett sávozással, majd dialízissel tisztítottuk. Egy másik replikációhiányos adenovírus, amely NIS-t tartalmaz a nem specifikus CMV promóter irányítása alatt, a korábbi kísérletekből volt készleten, és ugyanazon technikával állították elő. 16.

Az OVCAR-3 sejtek adenovírusfertőzése

A sejteket 12-lyukú lemezekre szélesztettük a fertőzés előtti napon 1,5x105 sejt/lyuk oltási sűrűséggel, hogy elérjük a fertőzés ~ 60% -os összefolyását. A sejteket ezután mossuk és szérummentes táptalajban inkubáljuk, és mindegyik lyukba különféle mennyiségű vírust adunk. 3 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a sejteket mostuk és teljes tápközegben inkubáltuk 72 órán keresztül, mielőtt a NIS expresszió/funkció elemzés megtörtént volna. Minden adenovírusfertőzés legalább három példányban fordult elő.

125 I abszorpciós vizsgálatok

A sejtek jodidkoncentrációs képességét Weiss és mtsai. Röviden, a transzfekció után a sejteket 10 mM HEPES-t, 10 μM NaI-t és 0,1 μCi Na125I/ml, pH 7, 3 és 10 μM KClO4-t tartalmazó HBSS-ben inkubáltuk, amely a NIS jodidfelvételének kompetitív inhibitora. 45 perces, 37 ° C-on végzett inkubálás után a sejteket jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mossuk, 1 M NaOH-val lizáljuk, és a koncentrált jodidot y-kollektoron mértük.

Membránelszívás

A membránfehérjéket a fent leírt eljárással extraháltuk fertőzött sejtekből. Röviden, a sejteket mostuk és újraszuszpendáltuk A pufferben (250 mM szacharóz, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF). majd egy éjszakán át -20 ° C-on fagyasztottuk. A sejtszuszpenziót ezután felolvasztottuk, és 500 g-on 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. 1 ml 1 M Na2C03-ot adtunk 1 ml felülúszóhoz, majd 4 ° C-on rázattuk. Az elegyet 45 percig 100 ° C-on centrifugáljuk, majd az üledéket B pufferben (250 mM szacharóz, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM MgCl2) szuszpendáljuk. A fehérjetartalmat a BioRad DC Protein Assay (Hercules, CA, USA) segítségével határoztuk meg.

Western blot elemzés

A Western blot elemzéshez NuPAGE elektroforézis rendszert (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) használtunk. A sejtvonalakból származó membránfehérjét (10 μg) DTT-ben (0,5 M) 10 percig 70 ° C-on redukáltuk. A mintákat ezután 4-12% NuPAGE Bis-Tris gradiens előregyártott poliakrilamid gélen futtattuk 1 órán át 200 V-on. A fehérje molekulatömeg-standardjainak alikvot részeit egyidejűleg hajtottuk végre minden egyes gélen, hogy összehasonlítsuk a minta méretét. Elektroblot-vizsgálatot végeztek 1 órán át 25 V-on, hogy a fehérjemintákat nitrocellulóz membránra vigyék át. A nem specifikus kötődés megakadályozása érdekében a membránokat 5% tejben TBS-T-ben (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20) inkubáltuk 1 órán át, majd TBS-T-ben mostuk. A membránokat az emberi NIS fehérje (aa 468-643) 38 ellen irányított egér monoklonális antitestben (1: 20 000 0,1% tejben) inkubáltuk 1,5 órán át, és TBS-T-ben mostuk. Ezután tormaperoxidázzal jelölt kecske egérellenes antitestet (1: 10 000) adtunk a membránokhoz 1,5 órán át. A mosási lépések után ECL Western Blotting Detection Reagenseket (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 1 percig felvittünk a membránokra. A Kodak BIOMAX MR filmeket ezután körülbelül 2 percig kitettük a membránok elé.

Immunhisztokémiai elemzés

A sejteket kétkamrás tárgylemezekre szélesztettük 1,5x105/mélyedési sűrűséggel a fertőzés és az immunhisztokémia előtt. A tárgylemezeket 15 percig jégre helyeztük, majd a sejteket hideg metanolban -20 ° C-on 15 percig rögzítettük. A metanol eltávolítása után a sejteket 10% normál kecskeszérumban (NGS) inkubáltuk PBS/0,05% Tween 20-ban (PBS-T) hígítva 30 percig a nem specifikus kötődés blokkolása céljából. Ezután humán NIS fehérje (aa 468-643) 38 elleni egér monoklonális antitestet (1: 2000) alkalmazunk 60 percig, majd PBS-T-ben mossuk. A sejteket ezután 20 percig biotinilezett kecske anti-egér immunglobulinnal (1: 200) inkubáltuk. A sejteket mostuk, majd peroxidázzal konjugált sztreptavidint (1: 300) adtunk 20 percig. Mosás után a detektálást peroxidáz szubsztrátkészlettel végeztük, amely kromogén-diaminobenzidint (DAB) tartalmazott (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A sejteket malachitzölddel ellenfestettük 5 percig, majd Dako® Glycergel szerelőközeggel (Carpintoria, CA, USA) szélesztettük.

A petefészek-xenograftok növekedése egerekben

Nőstény meztelen egerek (Harlan Sprague - Dawley, Indianapolis, IN, USA) 1 x 106 OVCAR-3 sejt szubkután injekciót kaptak 0,2 ml RPMI tápközegben szuszpendálva az egyik vagy mindkét oldalon. Amikor a daganatok elérték a megfelelő mennyiséget (

100 mm 3), az egereket alacsony jódtartalmú étrendbe helyeztük T4-tel (5 mg/l) kiegészített vízzel, hogy csökkentse a jód felvételét a pajzsmirigybe. Valamennyi kísérletet a Mayo Clinic (Rochester, MN, USA) útmutatásai szerint hagyták jóvá és hajtották végre.

A tumor xenograftok adenovírusfertőzése

⩾ 100 mm 3 daganatos egereknek, amelyeket alacsony jodidtartalmú étrenden tartottak, intratumorálisan 5x108 PFU rekombináns Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS vagy kontroll vírust injektáltunk 100 μl össztérfogatban. 3% szacharóz/PBS. A vírus diszperziójának növelése érdekében inzulinfecskendők segítségével több helyre injektálták a daganatokat. Ha szükséges, a vírusinjekciót megelőzően a daganatokat leszívták az aszcitikus folyadék eltávolítására.

Tumor képalkotás in vivo

3 nappal az OVCAR-3 daganatok vírusinjekciója után az egereket intraperitoneálisan 0,5 mCi 123I-vel injektáltuk, és nagy felbontású, alacsony energiájú kollimátoros gamma kamerával készítettük képeket. Sorozatképeket különféle időpontokban kaptunk a jodid beadása után 1–48 órával.

131 I terápia

Az egereket OVCAR-3 tumorméret és Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS vagy kontrollvírus intratumorális injekciói szerint csoportosítottuk a fent leírtak szerint. 3 nappal a vírus beadása után az egereket intraperitoneálisan vagy 3 mCi 131 I-gyel, vagy sóoldattal (kontrollcsoport) injektáltuk. A NIS által transzdukált és a kontroll tumorok mennyiségét monitoroztuk és összehasonlítottuk heti rendszerességgel a jodid beadása után mind a 131 I, mind a fiziológiás sóoldatban. A statisztikai elemzést Student-féle t-teszttel végeztük (párosítatlan). A statisztikai szignifikanciát P-érték ⩽ 0,05 jelezte.

rövidítések

köszönöm

A munka fő finanszírozási forrása a Prospect Creek Alapítvány volt. Támogatást nyertek a Mayo Alapítvány mellrák-támogatása, a prosztatarák-támogatás (CA91956) és a Mayo mellrák-program is.