s-100

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • Anyagok és metódusok
  • Jegyzőkönyv
  • Esetek értékelése és nyomon követése
  • immunhisztokémia
  • Fagyasztott részek elkészítése
  • az eredmény
  • Klinikai tünetek
  • Perifériás immunhisztokémia
  • Betegek egy csoportja
  • Fagyasztott szakaszok
  • vita

elemeket

  • Gyarmati betegségek
  • diagnózis
  • immunhisztokémia

absztrakt

A fő

A veleszületett bélaganglionosis vagy a Hirschsprung-kór az enterális idegrendszer fejlődési rendellenességének eredménye. A gyomor-bél traktus megfelelő motilitása megköveteli a beidegzést egy megfelelően fejlett és érett enterális idegrendszer által. A belső ganglion sejtek hiánya a disztális végbélből és a szomszédos bél változó hosszúsága a Hirschsprung-kór kívánatos diagnosztikai jellemzője. Az embriológiai fejlődés során a bél idegrostjai cudalisan vándorolnak a vagális rostokkal, és 12 héten belül megérkeznek a vastagbélbe. Tíz évvel ezelőtt kiderült, hogy az aganglionosis kialakulásában a funkcionális mutációk elvesztése több génben, beleértve a ret proto-onkogén ajkát is, szerepet játszik. 1 Ezekről a "funkcióvesztés" mutációkról ismert, hogy nemcsak a ganglion sejtek fejlődését és migrációját befolyásolják, hanem a ganglion sejtek korai pusztulásában is szerepet játszanak. 2

A rektális biopsziákat a ganglion sejtek jelenlétére vagy hiányára vizsgálják Hirschsprung-betegségben gyanús betegeknél. Bizonyos esetekben a ganglionsejtek azonosítása nehéz lehet, különösen a Hirschsprung-kórban szenvedő újszülött kialakulásának legnagyobb kockázatú populációban. Ezekben a betegeknél az éretlen ganglionsejtek összetéveszthetők az endothel sejtekkel, más mesenchymalis sejtekkel és gyulladásos sejtekkel. Ezért sok intézmény az aganglionosis diagnózisának kiegészítőjeként hisztokémiai festést végez a fagyasztott végbélszövet acetilkolin-észterázával. A fagyasztott szeletek ezen foltjainak pontos diagnosztizálása azonban magas szintű szakértelmet igényel, különösen tisztázatlan esetekben. 3, 4 Alternatív megoldásként az idegi hipertrófia azonosítása hasznos kiegészítő diagnosztikai mód lehet aganglionosis esetén. A Hirschsprung-kórban szenvedő betegek rektális biopsziáinak 90% -ánál kb. 40 μm átmérőjű submucosalis idegtörzsek vannak. 5.

Ezen diagnosztikai problémák eredményeként számos immunhisztokémiai folt alakult ki, amelyek segítenek a ganglion sejtek azonosításában. Antitestek a neuron-specifikus enológiával (NSE) szemben, 6, 7, perifériás, 7, 8, 9, 10 katepszin D, 8, 11 bcl-2, 12 NeuN, 13 csont morfogenetikus fehérjereceptor IA (BMPRIA), 14 neurofilamentum, 7, 15 tubulin, 15 ajak onkoprotein, 16 és újabban a MAP-2 17 sikeresen kiemelte a ganglion sejteket, amelyeket nehéz azonosítani a hematoxilin és az eozin (H&E) festéssel.

2002-ben perifériás immunhisztokémiai festést és H&E kiértékelést alkalmazva kidolgoztunk és megvalósítottunk egy protokollt a rektális biopsziák ganglionsejtjeinek azonosítására. Az irodalom tanulmányozása után a perifériát választottuk a ganglionsejtek fokozására, mivel azok a ganglionsejtek erős festését mutatták felnőtt és gyermek bélszövetekben. Észrevettük, hogy a szemcsés idegrostok enyhe immunfestést mutattak; azonban soha nem volt nehéz megkülönböztetni ezt a festést az egyedi és a ganglion sejtcsoportok tipikus sűrű citoplazmatikus festésétől. Az S-100 immunhisztokémiai festését is elvégeztük kiegészítésként az idegi hipertrófia azonosítására. Íme a protokollunk eredményei az elmúlt 7 évben.

Anyagok és metódusok

Jegyzőkönyv

A protokoll nyolc H&E szintből, két perifériás antitestből és két S-100 immunvizsgálatból áll. Az immunfestéshez festetlen tárgylemezeket kaptunk a blokk 3., 4. és 8., 9. szintjén. Hacsak a ganglion sejteket nem azonosították az eredeti protokoll szerint, további H&E és perifériás festést végeztek.

Hét év alatt intézményünk 10 patológusa értelmezte ezeket a végbélbiopsziákat. Ha a kezdeti protokollban nem voltak ganglionsejtek, akkor különbségek voltak a diagnosztizáló patológusok között a további H&E és immunfestékek szintjeinek számában, amelyek elrendeződtek. A megrendelt H & Esek száma további 10 szinttől a soros szakaszokig terjedt a blokkon keresztül.

Esetek értékelése és nyomon követése

Az Intézményi Felülvizsgálati Testület jóváhagyását követően a Hirschsprung-kór kizárására kapott összes biopsziát a Grúziai Orvostudományi Kar Patológiai Levéltárából szerezték be 2002 és 2009 között. Valamennyi esetet a perinin és az S-100 immunhisztokémiai festésének protokolljával diagnosztizálták. . Minden esetet kiértékeltünk a ganglion sejtek jelenléte vagy hiánya és az ideg hipertrófia szempontjából. Ha ganglion sejtek voltak jelen, meghatároztuk, hogy kimutatták-e őket a kezdeti protokollban vagy ismételt szinten. Ha ganglionsejtek hiányoztak, kiértékeltük a reszekciós mintákat az agangli szegmens jelenlétére vagy hiányára. A rendelkezésre álló nyomon követést a beteggráf-elemzések segítségével kaptuk. Ezenkívül egy áttekintést végeztek a fagyasztott szakaszokon átesett betegek értékelésére.

immunhisztokémia

Az immunhisztokémiát a replikációs szakaszok xilol-deparaffinizálása után és standard avidin-biotin komplex módszer alkalmazásával végeztük. A következő antigének elleni antitesteket használtuk: perifériás (PJM50 monoklonális; 1: 100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) és S-100 (poliklonális; 1: 6000; Dako Corporation, Carpenteria, CA, USA). A perifériás immunhisztokémiai antigéngyűjtés nyomástartó fűtést eredményezett, amelynek cél-pH-értéke 6, 0. Az S-100 immunhisztokémia során előkezelést nem alkalmaztunk.

A periféria immunológiai festését pozitívnak tekintettük, ha a ganglion sejtek jellegzetes citoplazmatikus festését azonosítottuk az idegfonatban (1a. És b. Ábra). A submucosalis idegrostok maximális átmérőjét S-100-mal végzett vizuális mikrometriával végzett immunfestéssel értékeltük. Ganglion-pozitív esetekben ügyeltek arra, hogy ne mérjék meg az idegrostok hagymatágulását, amikor azok a ganglionokon átfolynak (1d. Ábra).

a ) Perifériás ganglionsejt-klaszterek tipikus immunfestése (× 40). b ) A ganglion sejtek perifériás festése szemcsés lerakódásokkal az idegkötegben (nyíl) a ganglion bejáratánál (x 100). c ) a submucosa (nyilak) kis idegkötegeinek gyenge lineáris és szemcsés immunfestése (× 40). ( d ) Negatív ganglion sejtfestés Hirschsprung beteg nélküli S-100 immunfestéssel (x 100).

Teljes méretű kép

Fagyasztott részek elkészítése

A fagyasztott szakaszokra kapott szöveteket 5 μm-es metszetekre vágtuk egy szokásos protokoll szerint. Az egyik tárgylemezt 95% -os etanolban rögzítettük és H & E-vel festettük. A második tárgylemezt levegőn száradni hagytuk, és standard Diff Quick protokollal megfestettük.

az eredmény

Klinikai tünetek

138 egymást követő esetet választottak ki értékelésre. Két eset nem volt diagnosztizálható a submucosalis szövet hiánya miatt, és ismételt biopsziákat nem végeztek. A fennmaradó esetekben 90 férfi és 46 nő volt. Százkilenc betegnek voltak ganglionsejtjei, ebből 66 férfi és 43 nő volt. A 27 ganglionsejt nélküli beteg közül 23 férfi és 4 nő volt, ami megfelel a férfiak túlsúlyának a Hirschsprung-kórban.

A betegek életkora 2 naptól 55 évig terjedt. Negyvenegy (41%) ganglionsejtes beteg van jelen 1, 2, 3 éves korban, és a sebészek kérésére ismételt ganglionsejt-biopsziát végeztek. A vakbél perforációban és ganglion sejtekben egy beteget azonosítottak a függelékben és a függelékben. Az ezt követő rektális biopszia pozitív volt a ganglion sejtekben. Egy beteg pitvari disztális vastagbél reszekción esett át, a ganglion sejtek megerősítésével a reszektált szegmensben. Az ezt követő rektális biopszia pozitív volt a ganglion sejtekben.

Az S-100 immunhisztokémiai festését 107 ganglionsejtes betegnél értékelhettük (átlagos átmérője 20 μm (8–55 μm tartomány)). Közülük 103 idegköteget rejtett el

a ) Az S-100 immunológiai festése a neurális hipertrófiát hangsúlyozza a Hirschsprung-kórban szenvedő betegeknél (× 40). ( b ) A muscularis nyálkahártya és a lamina megnövekedett idegrostja, amelyet Hirschsprung-kórban szenvedő beteg okoz az S-100 festéskor (× 100). c ) A diffúz Quik festés fényes kék ganglion sejt citoplazmát mutat (x 40). d ) a fagyasztott szakasz ellenőrzése H&E felhasználásával (× 20).

Teljes méretű kép

Fagyasztott szakaszok

A fagyasztott metszetek elemzését 26 betegnél végeztük. Ebből a 26-ból 22 betegnek volt reszekciója a Hirschsprung-kór miatt, kettőnek ismételt biopsziája volt (intenzív megerősítés a ganglion sejtek jelenlétéről), kettőnek pedig de novo biopsziája volt. A Diff Quick protokoll élénkkékkel festette a ganglion sejtek citoplazmáját, felgyorsítva az intraoperatív értékelést (2c. És d. Ábra). Ezekben a betegeknél összesen 57 fagyasztott metszetet végeztek, 95% (57-ből 54) egyetértett az állandó szakaszokkal. A három kiugró érték mintavételi hibának bizonyult.

vita

Történelmileg a submucosalis idegtörzsek, valamint a muscularis és a lamina propria idegtörzsek értékelése kulcsfontosságú volt az aganglionosisban gyanús betegek megerősítésében. Az acetilkolin-észterázzal végzett hisztokémiai festést széles körben alkalmazzák a rektális biopsziákban a parasimpatikus idegek azonosításának és tipizálásának kiegészítéseként. A fagyott szövet megszerzését igénylő folyamat potenciálisan mérgező és időigényes. Ezenkívül a foltok nehezen értelmezhetők, különösen tisztázatlan esetekben. 3, 4 A festés értelmezésének követelményeit hamis pozitív, 4, 5, 6, 8, 9 hamis negatív, 18, 19, 20, 21, 22 és nem egyértelmű 19, 22 eredmények dokumentálják.

Megállapítottuk, hogy a Diff Quik festés alkalmazása fagyasztott szöveteken hangsúlyozza a ganglion sejteket azáltal, hogy citoplazmájukat élénk kék színnel festik. A festés könnyen elérhető, olcsó és nem mérgező, és közvetlenül alkalmazható a fagyasztott szövetrészekre. Ezenkívül nem igényel semmilyen műszaki ismeretet. A ganglionsejtekben található élénkkék festés és a többi szövet halványlila festése közötti kontraszt megkönnyíti a ganglionsejtek gyors és könnyű azonosítását az intraoperatív környezetben. A H- és E-festett tárgylemezekkel együtt alkalmazva a Diff Quik foltok kiegészítőként működnek, lerövidítve a lefagyott szakaszok értelmezési idejét.

Összefoglalva, az adjuváns immunhisztokémiai festékperifériához és az S-100-hoz kapcsolódó számos H&E szakasz alapos vizsgálata rendkívül érzékeny és specifikus modalitásnak bizonyult a ganglion sejtek azonosításában a szívó rektális biopsziákban. A vizsgálat során ez a diagnosztikai pontosság számos nematogastinalis és nem gyermek patológusnál megmaradt. Ez a protokoll javította a laboratóriumi hatékonyságot, mivel a H&E soros szakaszokra az esetek kevesebb mint 30% -ában volt szükség. Ezenkívül nem volt szükség a fagyott szövet rutinszerű visszakeresésére. Mindezt úgy sikerült elérni, hogy az esetek 93% -ában fenntartották a 24 órás átfutási időt.