A Clostridium difficile által okozott fertőzések laboratóriumi diagnózisának lehetőségei

Absztrakt:

A toxintermeléssel járó Clostridium difficile a kórházi bélfertőzések leggyakoribb oka. A C. difficile vastagbélgyulladás különböző súlyosságú fertőző betegség, előfordulhat gyakori hasmenéses betegségként, pseudomembranosus vastagbélgyulladásként, de életveszélyes állapotként is, kísérve a paralitikus ileust, amely másodlagos szepszissé fejlődik. A betegség leggyakrabban a széles spektrumú antibiotikumokkal történő kezeléssel összefüggésben fordul elő, amelyek kiküszöbölik a normális bélflórát. A C. difficile terjedése spórákkal történik széklet-orális úton. A C. difficile fertőzések korai diagnózisa fontos a megfelelő terápia megkezdése, valamint járványellenes intézkedések miatt, amelyek megakadályozzák a spórák további terjedését a kórházi környezetben.

fertőzések

Kulcsszavak: Clostridium difficile fertőzések, pseudomembranosus colitis, laboratóriumi diagnosztika, glutamát dehidrogenáz, toxigén törzs

* A cikk részét képező összes táblázat, grafikon és ábra a tanulmány végén található csatolt PDF fájlban található.

Bevezetés

A betegség patogenezise

A betegség epidemiológiája

Terápia

A CDI kezelési eljárásait rögzítik a C. difficile által okozott vastagbélgyulladás diagnosztizálására és kezelésére vonatkozó szlovák ajánlások (7). A CDI enyhe formáinak kezelésében alkalmazott általános ajánlások: a fertőzést okozó ATB-kezelés leállítása (ha lehetséges), rehidráció, maradékmentes étrend. Ha a beteg albuminszintje alacsony, parenterális szubsztitúcióra van szükség. A bél perisztaltikáját elnyomó gyógyszerek (görcsoldók, opiátok) ellenjavallt. A CDI közepes, súlyos és visszatérő formáinak kezelésére gyógyszeres antibiotikum-kezelés javasolt: metronidazol, vankomicin és az új makrociklusos antibiotikum fidaxomicin. A probiotikumokat a támogató kezelés egyéb lehetőségeként használják, és az elmúlt időszakban az ún széklet bakterioterápia. A székletátültetés hivatalosan ajánlott módszer a CDI többszöri kiújulásának kezelésére, nagy sikerességi arány mellett, amely felülkerekedik a meglévő antibiotikum-kezeléseken is (13).

Laboratóriumi diagnosztika CDI

Ma már számos módszert alkalmaznak a CDI mikrobiológiai diagnózisára. Mindegyiknek más és más érzékenysége és specifitása van, ezért kombináció ajánlott. A széklet célzott mikrobiológiai vizsgálata javallt olyan betegeknél, akiknél CDI klinikai gyanúja merül fel. Éppen ellenkezőleg, nem javallt öntött székletben szenvedő betegeknél, és általában nem 1-2 év alatti gyermekeknél.

Az antigén igazolása C. difficile

A glutamát-dehidrogenáz (GDH) egy specifikus antigén - exoenzim, amelyet a C. difficile összes (toxigén és nem toxigén) törzse termel. Az antigén igazolása közvetlenül a székletből lehetséges, a teszt specifitása 80 - 100%. Magas negatív prediktív értéke (NPV), t. j. negatív eredmény nagy valószínűséggel kizárja a Clostridial fertőzés lehetőségét. A teszt azonban nem tesz különbséget a toxigén és a nem toxigén törzsek között. Hátránya továbbá a Clostridium spp. Más fajaival való keresztreakció lehetősége. jelen van a székletben (hamis pozitív eredmény 20% -ban). A GDH külön-külön, vagy a C. difficile toxinokat is kimutató tesztek részeként határozható meg.

A toxinok bizonyítékai C. difficile (A/B)

Az A/B toxinok kimutatásához az enzimhez kapcsolt immunszorbens teszt vagy az immunokromatográfia elvén alapuló diagnosztikai készleteket használnak. Jelenleg számos kereskedelmi készlet elérhető a piacon, különböző érzékenységgel és sajátosságokkal. Előnyük a megfizethetőség, a sebesség, a magas specifikusság, az egyszerű kialakítás, a törzs toxigenicitásának bizonyítékainak egyértelmű értelmezésével. A tesztnek magas a pozitív prediktív értéke (PPV), t. j. pozitív eredmény nagy valószínűséggel Clostridial fertőzést bizonyít. Hátránya a viszonylag alacsony érzékenység (90%), amely egyes esetekben hamis negatív eredményekhez vezet.

Anaerob termesztés

A C. difficile anaerob tenyésztése meglehetősen megterhelő és hosszadalmas (2-3 nap). A termesztéshez cefoxitint és cikloserint tartalmazó szelektív talajokat használnak, amelyek elnyomják a kísérő flórát. A tenyészlelet megerősítése mikroszkópos (orientációs), biokémiai (kereskedelmi anaerotesztekkel), latex agglutinációs teszttel lehetséges, vagy újabb technikák alkalmazásával (PCR - polimeráz láncreakció, MALDI TOF MS - mátrix segített lézeres deszorpciós ionizációs idő, repülési tömegspektrometriás idő). Tenyésztési tesztet tartanak szükségesnek minden olyan székletmintához, amelyben megerősítették a GDH-pozitivitást, beleértve a toxin-negatív székletet is. A termesztett tenyészetből származó toxinok kimutatására immunokémiai vizsgálatok vagy PCR használhatók. A tenyészvizsgálat előnye a magas hozam, az izolált kultúrák tárolásának lehetősége, az antibiotikumok iránti érzékenység (ATB) meghatározása, ill. molekuláris tipizálás (epidemiológiai célokra).

A citotoxicitás kimutatása szövettenyészetekben

A szövetkultúrák citotoxicitásának bizonyítása meglehetősen történelmi jelentőségű. Ez a módszer időigényes, laboratóriumi felszerelés és értelmezési tapasztalat, hátránya a hamis pozitivitás kockázata. Az érzékenység 94-100%. A citotoxin kimutatható a székletben vagy izolált difficile törzsből fibroblaszt szövetkultúrákon, ahol citopátiás hatás lép fel.

PCR - toxicitási gének bizonyítékai

A PCR-módszerek bevezetése, akár szűrővizsgálatként, akár megerősítő módszerként, a CDI diagnózisában európai tendencia. Nagy érzékenység (99 - 100%) és specifitás jellemzi őket, ami jelentősen lerövidíti az eredmény eléréséhez szükséges időt. A PPV értéke paradox módon csökken, mert a PCR annyira érzékeny, hogy a normál kolonizációban jelen lévő kis mennyiségű toxigén C. difficile is kimutatható a mintában, így nem különböztetve meg a kolonizációt a fertőzéstől (14). Ma már vannak kereskedelmi készleteink (a valós idejű PCR elve alapján) a toxin B termeléséhez szükséges gén, a bináris toxin gén kimutatására, készleteink néhány járványos PCR ribotípusra jellemző pl. A PCR különösen fontos a CDI súlyos formáinak ellenőrzésében és a korábbi vizsgálatok homályos eredményeinek megerősítésében.

Gépelés C. difficile epidemiológiai célokra

A fejlett diagnosztikai módszerek közé tartozik a ribotipizálás és a toxinotipizálás, amelyek a pulzáló gélelektroforézissel végzett PCR-en és makro-restrikciós elemzésen alapulnak (2). A C. difficile ribotipizálása során a 16S és 23S rRNS génjei közötti régió (úgynevezett Intergenic Spacer Region) amplifikálódik. Különbség van az egyes ribotípusok között e gének jelen lévő alléljainak számában és az allélok közötti szakaszok hosszában (6). Mindegyik RT sajátos elektroforetikus profilt képez, amely alapján később azonosítják. Egy adott RT meghatározásához a kapott elektroforeogramokat összehasonlítjuk a https://webribo.ages.at/ osztrák webadatbázissal. Összesen több mint 800 PCR ribotípust és 24 toxinotípust fedeztek fel.

Ajánlott diagnosztikai eljárás

Anyag és módszertan

Feliratkozás biológiai anyag és szállítás a laboratóriumba A C. difficile jelenlétére szolgáló széklet mikrobiológiai vizsgálatához legalább 2 ml ürüléket kell steril edénybe gyűjteni. A székletet két órán belül fel kell dolgozni és meg kell vizsgálni, mivel a toxinok viszonylag instabilak, gyorsan szétesnek, és hamis negativitást eredményezhetnek. Ha a székletet nem lehet azonnal megvizsgálni a begyűjtés után, tanácsos a mintát hűtőszekrény hőmérsékletén (kb. 5 ° C) tartani, majd a toxin stabilitása 48 órán keresztül biztosított. A minták hosszú távú tárolásához a székletmintát mélyfagyasztani kell -70 ° C-on.

Az eredmények

5 hónap alatt 3 kórház 481 hasmenéses székletét vizsgálták. Áttekintés az egyes osztályokról, amelyekből a vizsgált minták származnak az 1. táblázatban. A vizsgált széklet teljes számából 104 GDH minta volt pozitív (21,6%). A sikertelenül megművelt eltávolítás után másolatot, ill. három minta maradt 66 mintában (66 beteg). Az ezen székletből származó C. difficile izolátumokat molekuláris tipizálásnak vetették alá. A 66 minta közül 58 (87,9%) toxigén (tcdA és tcdB gén volt jelen), amelyek közül 6 izolátumnak bináris toxin génje is volt (cdtA, cdtB). A készletből a fennmaradó 8 minta (12,1%) nem volt mérgező, azaz. j. nem mutatták ki a toxintermelés egyik génjének jelenlétét. Háromlépcsős diagnosztikai algoritmus és más módszerek kombinációja (a toxinok immunokromatográfiás meghatározása és a toxigenicitás PCR-rel történő kimutatása) segítségével kiderült, hogy 58 toxin-pozitív székletből 35 mintában volt pozitív toxin közvetlenül a székletből, és 23 mintában ( toxin-negatív a székletből) a toxigénné, a tenyészet megerősítette a toxinok pozitivitását (2. táblázat).

Következtetés