A túlzottan expresszált fehérje tisztítása képezi a tiszta, rekombináns fehérje termelésének második és nem kevésbé fontos szakaszát egy heterológ expressziós rendszerben. Ritkán kapunk rekombináns fehérjét közvetlenül folyékony, extracelluláris táptalajból (táptalaj), bár egyes expressziós rendszerek lehetővé teszik az ilyen fehérjeválasztást. Bármely molekula biológiai anyagból történő megtisztításának első lépése a sejtfal és a citoplazmatikus membrán megbontása, ezáltal oldatba bocsátása.
A sejtbontásnak több módját ismerjük:
- megismételt fagyás és olvadás anyag - a rendellenességet jégkristályok képződése okozza (egyes fehérjéket denaturálhat)
- mechanikai - homogenizálás habarcsban vagy összetettebb berendezésben
- kémiai - különféle erős detergensek, oldószerek (ezek denaturálhatnak néhány fehérjét; a membránfehérjék szolubilizálására kell használni - pl. Triton X-100, CHAPS)
- enzimatikus - enzimek hatása a sejtfalakra (pl. cellulázok, pektinázok, lizozim baktériumokhoz, zymoláz élesztőhöz)
A fehérjék esetében az "agresszív" módszer (vagy a módszerek kombinációja) függ azok elhelyezkedésétől (pl. Sejtmag, citoplazma, membránfehérje, gram-negatív baktériumok esetén a periplazmatikus lokalizáció), valamint származásuktól és természettől (a sejtfal jelenléte).) felhasználásával:
- elegendő mennyiségű fehérjét szabadított fel oldatba, azaz oldható fázis
- megtartja a fehérje alakját (konformációját) és biológiai aktivitását
Homogenizációs kapcsolat
A homogenizálás a sejtbontás egyik mechanikus módszere. Homogenizálás után a fehérjéket oldatba hozzák, amelynek bizonyos megfelelő összetételűnek és pH-értékűnek kell lennie annak érdekében, hogy ne veszítsék el biológiai tulajdonságait. Felhívjuk puffer (puffer), mert "csillapítja" a pH-ingadozásokat, amelyeket a különféle jelenlévő kémiai vegyületek okoznak.
| puffer | pH-tartomány |
| foszfát (NaH2PO4 + Na2HPO4) | 5,8 - 8,0 |
| Tris-HCl | 7,0 - 9,0 |
| citrát (nátrium-acetát + citromsav) | 3,0 - 6,2 |
A leggyakrabban használt homogenizátorok a következők:
- Potter homogenizátor - a legelterjedtebb anyag az állati eredetű sejttenyészetek, amelyeket homogenizálunk, ha a dugattyút henger alakú üveghabarcshoz dörzsöljük.
- ultrahangos homogenizátor, ún. szonikátor - ultrahangos hullámokat használ a sejtek megzavarására
- francia sajtó - hidraulikus szivattyú segítségével nagy nyomást (6000-10000 psi) alkalmaznak a cella szuszpenzióra, majd a szuszpenziót hirtelen kisütik egy keskeny kapillárison keresztül, a sejtek a kamrából kilépő dekompresszió és nyíróerő miatt felszakadnak; A francia sajtót elsősorban a baktériumok sejtjeiből származó fehérjék kivonására használják
- homogenizátorok, amelyek a gyöngyök kinetikus energiájába transzformált mágneses erőt alkalmaznak a sejtek megbontására, amely súrlódással és a szuszpenzió keverésével roncsolja a sejtfelületet; gyakran használják fehérjék kivonására állati szervekből és szövetekből
A homogenizálás szuszpenziót eredményez - homogenizátum.
Puffer adalékok összekapcsolása
A pufferoldatban nem mindig szükséges különféle vegyi anyagokat használni. Ezek olyan anyagok, amelyek segítenek bizonyos fehérjék oldódásában vagy stabilizálásában. A megfelelően kiválasztott adalékanyagok nem befolyásolhatják az egyéb tisztítási eljárásokat, vagy dialízissel vagy gélszűréssel eltávolítható legyen az oldatból.
| csoport | példa | végső koncentráció | használati cél |
| só | NaCl, KCl, (NH4) 2S04 | 50-150 mM | az oldat ionerősségének fenntartása, a fehérjék kölcsönhatása a hordozóval, a fehérjék kicsapása |
| mosószerek | Triton X-100, NP-40, CHAPS | 0,1-1% | membránfehérjék szolubilizációja |
| glicerin | - | 5-10% | a fehérje aggregációjának stabilizálása és megelőzése |
| szénhidrátok | glükóz, szacharóz | 25 mM | a lizoszóma membránok stabilizálása megakadályozza a proteáz szekrécióját |
| kétértékű kation kelátképzők ("ártalmatlanítók") | EDTA, EGTA | 1 mM | az oxidatív károsodás csökkentése, egyes proteázok gátlása |
| redukálószerek | DTT | 1-10 mM | az oxidatív károsodás csökkentése, nagyobb koncentráció esetén az S-S kötések csökkenése |
| β-merkaptoetanol | 0,05% | ||
| ligandumok, fémionok | Mg 2+, ATP, GTP | 1-10 mM | egyes fehérjék stabilizálása |
Ultracentrifugációs kapcsolat
A homogenátum különféle nagy és nehéz részecskéket (sejttörmelék, azaz sejttörmelék, organellák, membránok) és oldható anyag (A1, B2 ábra). Különböző centrifugálási ciklusok alkalmazásával, különböző sebességgel és idővel bizonyos mértékig szétválaszthatunk bizonyos frakciókat a kívánt fehérjékkel (A. ábra). A nagyon kis sebességgel (500 g/10 perc) végzett centrifugálás lehetővé teszi a legnehezebb sejtmagok izolálását (A2. Ábra), így alkalmas a nukleáris fehérjék extrahálására. Feltételezve, hogy rekombináns fehérjénk oldódik, nagyobb sebességgel (10 000 g/20 perc) centrifugálunk, hogy eltávolítsuk a felesleges, szennyező anyagok nagy részét. Ezzel szemben a membránrészecskék membránfehérjékkel történő izolálása ultracentrifugálást igényel (100 000 g/60 perc) (A3. Ábra). Centrifugálással a szuszpenzió oldhatatlanra oszlik üledék (pellet) (a cső alján) és felülúszó (megoldás).
Néha azonban hasznos lehet sűrűség gradiens differenciál centrifugálás (pl. szacharóz) (B1. ábra), különösen, ha a rekombináns fehérje-aggregátumok által képzett sejtorganellákat vagy könnyebb zárványtesteket el akarjuk választani a sejttörmeléktől. Ebben az esetben a legnehezebb törmelék leülepszik a cső aljára, de a könnyebb részecskék nem eshetnek a töményebb szacharóz-oldat szintje alá. Az eredmény egy pellet, amelyet a szacharóz sűrűsége szerint külön frakciókra osztunk (B3. Ábra). Az oldható anyag mindig a legfelső frakcióban lesz, mert ez a legkönnyebb.
Fehérje kicsapódási kapcsolat
Ezenkívül a fehérjéket gyakran szelektíven kell kicsapni - kicsapódik heterogén oldatból. A leggyakrabban használt vegyszer ammónium-szulfát - (NH4) 2SO4, amely az ún fokozatos kisózó hatás fehérjék, eltérő ionerősségű oldatban való oldhatóságuk függvényében. Az elv alapvetően az ammónium-szulfát és a fehérje "versengése" az oldószer (víz) molekulákért. A kivált fehérje aggregátumokat képez (hidrofób kölcsönhatások révén), így elválasztható az oldható fázistól centrifugálás. Ily módon lehetséges az ammónium-szulfát koncentrációjának növekedésével több, különböző fehérjét tartalmazó frakció összegyűjtése, és ezeknek a frakcióknak az elemzése a szóban forgó rekombináns fehérje jelenlétére vonatkozóan (például SDS-PAGE segítségével).
A fehérjék ily módon történő kicsapódása nem okozza a fehérjék denaturálódását. Az ammónium-szulfát dialízissel távolítható el az oldatból. Gyors és olcsó módszer a legtöbb szennyező fehérje kezdeti eltávolítására.
Dialízis link
A fehérjeoldat dialízise olyan módszer kis molekulatömegű vegyi anyagok eltávolítására az oldatból, amelyek hátrányosan befolyásolhatják a további tisztítási lépéseket, vagy a fehérje biológiai tulajdonságai. A dialízis dialízis zacskókban történik, pufferban állandó keverés mellett, alacsony hőmérsékleten (4 ° C). A dialízis zacskó pórusai csak kis molekulák átengedését engedik addig, amíg az egyensúly a két oldat összetétele között el nem ér. A fehérje zárva marad a dialízis zsák belsejében.
Dialízissel egyes fehérjék újraterhelhetők biológiailag aktív konformációvá. Annak érdekében, hogy a renaturáció a lehető leghatékonyabb legyen, nagyon lassan, gyakran nagyon híg oldatban, tehát nagy térfogatban kell végbemennie.